Pruebas genotípicas

Las pruebas genotípicas tienen como base el análisis del genoma y por tanto encuentran la presencia de mutaciones. En función del principio en que se basen, el número de mutaciones detectables es distinto. Las técnicas que utilizan la secuenciación, detectan todas las mutaciones presentes en las regiones del genoma del VIH que codifican para la retrotranscriptasa y para la proteasa. Cuando el fundamento de la técnica es la hibridación, sólo se encuentra determinado número de mutaciones de significación conocida.

Pruebas genotípicas comerciales:
Existen tres pruebas genotípicas comerciales, la secuenciación directa de ARN retroviral y dos técnicas basadas en la hibridación (LiPATM y GeneChipTM), cuyo fundamento se describe brevemente a continuación.
Secuenciación: el principio general de esta técnica consiste en la obtención de moléculas de ADN, un nucleótido más largo que la precedente y su posterior separación mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de alta resolución.
En la actualidad, aunque el principio básico no ha cambiado, las técnicas modernas de secuenciación se derivan del método de Sanger, según el cual en lugar de fraccionar el ADN en cuestión, se procede a la síntesis de pequeños fragmentos a partir de la cadena molde. Esta síntesis tiene una peculiaridad, que es la incorporación de nucleótidos terminadores de cadena. Estos nucleótidos en realidad son didesoxinucleótidos-5´-trifosfato (ddNTP), es decir, carecen de grupo hidroxilo (OH) en posición 3', que es fundamental para la elongación de la cadena, porque es precisamente en esta posición donde la polimerasa inserta el siguiente nucleótido durante la síntesis de ADN. La adición de la proporción adecuada de nucleótidos naturales con respecto a estos didesoxinucleótidos dará lugar a la síntesis de fragmentos de diversos tamaños.
Para secuenciar el VIH se pueden adoptar dos estrategias: la secuenciación del genoma proviral integrado en los linfocitos, que ya está como ADN, o la realización de una retrotranscripción previa de ARN viral plasmático, para obtener una colección de ADN retrovirales. Para poder obtener secuencias confiables, un requisito fundamental es la idoneidad del material de partida, tanto en pureza como en cantidad. Para garantizar este aspecto se realiza, en primera instancia, una PCR “anidada”, que son dos PCR seguidas, de forma que el amplificado conseguido es mucho más abundante que si se realizase una PCR ordinaria. Tras la obtención del material genético suficiente se procede a la purificación del amplificado para eliminar restos de iniciadores, sales, enzimas, nucleótidos, etc.
Una vez obtenidos todos los fragmentos se procede a su separación electroforética, que se realiza de forma automatizada en un secuenciador; ésta puede ser según la clásica PAGE de alta resolución o mediante electroforesis capilar. Independientemente de la técnica de electroforesis acoplada al secuenciador, los fragmentos se separarán en función de su tamaño molecular. Las señales se recogen en un procesador electrónico acoplado al secuenciador y éste deduce la secuencia por comparación de los fragmentos solapantes, de manera que esta secuencia en realidad es una secuencia consenso que representa las secuencias de las subpoblaciones virales mayoritarias.
Para determinar la presencia de mutaciones que confieren resistencia a los antirretrovirales se extrae el genoma de una muestra del paciente y se procede a su secuenciación. Una vez obtenida la secuencia del VIH de la muestra problema, la secuencia obtenida del gen RT o de la proteasa se compara con las correspondientes secuencias de una cepa salvaje del VIH prototipo no resistente utilizando un programa informático acoplado al secuenciador.
LiPATM: el fundamento de esta técnica es una hibridación reversa post-PCR. El soporte de la hibridación consiste en tiras de nitrocelulosa con sondas de oligonucleótidos específicos inmovilizadas en líneas paralelas. Estas sondas son complementarias a la secuencia de mutaciones conocidas que confieren resistencia a los fármacos antirretrovirales. La amplificación de la muestra se realiza con oligonucleótidos cebadores biotinilados que permitirán el revelado de la reacción. Después de la hibridación se añade un conjugado compuesto por estreptavidina-fosfatasa alcalina, que se unirá a cualquier híbrido formado sobre la tira. Al añadir el sustrato de la enzima se producirá un precipitado marrón-púrpura en las posiciones correspondientes.
VIH GeneChipTM (Affimetrix): a pesar de que el fundamento de esta técnica es una hibridación, el resultado final es la secuenciación del material amplificado a partir de la muestra. El soporte de hibridación son microarreglos de ADN o “chips” de silicio que contienen una “biblioteca combinatoria” de sondas, que consiste en una gran cantidad de oligonucleótidos solapantes. La hibridación de estos microarreglos con ADN retroviral va a permitir identificar el nucleótido presente en cada posición de la secuencia a analizar. Como los productos de RT-PCR están marcados, permitirá deducir la secuencia la detección de fluorescencia tras la hibridación mediante barrido de láser e integración de las señales obtenidas con un programa informático. Una ventaja de esta técnica es que permite el análisis simultáneo de un elevado número de muestras.